De ziekte van Cushing kan worden vastgesteld aan de hand van verschillende onderzoeken. De eerste stap is vaak een bloedonderzoek om te bepalen of er sprake is van verhoogde cortisolwaarden in het bloed. Als deze waarden verhoogd zijn, kan er vervolgens een dexamethason-onderdrukkingstest worden uitgevoerd. Hierbij krijgt de patiënt een synthetisch cortisol (dexamethason) toegediend om te zien of dit de productie van cortisol door de bijnieren onderdrukt. Als dit niet het geval is, kan dit duiden op de ziekte van Cushing.
Daarnaast kan er ook een urinetest worden uitgevoerd om de hoeveelheid cortisol in de urine te meten. Een MRI-scan kan ook worden gebruikt om eventuele tumoren in de hypofyse of bijnieren op te sporen, die verantwoordelijk kunnen zijn voor de overproductie van cortisol. Een bloeddrukmeting kan daarnaast ook helpen bij het vaststellen van de ziekte van Cushing, omdat deze vaak hoger is bij mensen met deze aandoening.